一、實驗目的
依托芬蘭Kibron Delta‑8高通量表麵張力分析儀為主、Epsilon動態張力儀為輔，對餐廚垃圾發酵體係樣品開展批量檢測。通過測定發酵上清動態表麵張力、油水界麵張力，篩選可以利用餐廚垃圾作為底物、高效分泌生物表麵活性劑的功能菌株；同時探究發酵時間、初始pH、固液比、接種量等條件對於表活產出的影響，確定餐廚垃圾發酵製備生物表麵活性劑的最優工藝參數，整套流程可實現大批量樣品快速篩查。
二、實驗前期準備
1.儀器與耗材準備
核心儀器：Kibron Delta‑8高通量表麵張力檢測儀（96孔/384孔微孔板檢測，用於大批量初篩）；Kibron‑Epsilon動態界麵張力儀，用於優選樣品開展長時間界麵吸附動力學以及原油‑水界麵張力測試；配備Wilhelmy合金探針陣列、帕爾貼恒溫載台、低吸附微孔板、探針火焰灼燒清潔組件、配套數據采集軟件。
輔助設備：恒溫振蕩培養箱、高速冷凍離心機、pH計、電子天平、0.22 μm水係濾膜、超聲清洗機、多通道移液槍、無菌離心管。
實驗耗材：分選除雜之後的餐廚垃圾（去除硬物、油脂殘渣預處理）、待篩微生物菌株、無機鹽營養液、鹽酸‑氫氧化鈉pH調節劑、原油（油水界麵張力測試底物）、無水乙醇、異丙醇、超純水。
儀器預處理規範
1. 設備通電預熱30 min，設定發酵適配溫度30 ℃，後續全部樣品檢測溫度恒定不變。
2. 探針陣列開啟高溫灼燒清潔，燒除殘留有機質；之後進行純水基線校準，純水表麵張力穩定維持71.8~72.2 mN/m，基線連續30 min波動小於0.2 mN/m方可進行實驗。
3. 微孔板使用異丙醇、無水乙醇、超純水依次衝洗，氮氣吹幹；操作期間禁止觸碰微孔內側，防止皮脂汙染氣‑液界麵。儀器放置減震台麵，關閉防風擋板，規避氣流擾動微孔液麵。
2.餐廚垃圾發酵實驗組搭建與樣品預處理
1.餐廚垃圾底物預處理
餐廚垃圾剔除骨頭、塑料等雜質，粉碎均質，按照實驗梯度調配固液比，添加基礎無機鹽培養液，調節初始pH。
2.實驗組設置
空白對照組：隻含有餐廚‑營養液、沒有接入菌種的空白發酵體係，其餘培養條件保持一致；
菌株篩選組：接入不同候選功能菌株的餐廚垃圾發酵體係；
工藝優化組：設置不同發酵時長、初始pH、菌種接種量、餐廚垃圾固液比；
所有組別設置3組生物學平行，放置恒溫搖床振蕩發酵。
按照0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h定時取樣。
3.發酵上清預處理
（1）取出發酵原液，8000 r/min離心15 min，沉降餐廚垃圾固體殘渣、菌體沉澱，緩慢吸取上層黃褐色澄清上清液；
（2）上清懸浮雜質較多時選用0.22 μm水係濾頭緩慢過濾，不可使用有機濾膜，避免疏水類脂肽、糖脂被吸附損耗；上清清澈則直接跳過過濾；
（3）待測上清放置恒溫環境預溫至30 ℃，超聲脫氣10 min，除去溶液內部微小氣泡；
（4）樣品現取現測，4 ℃存放時長不能超過12 h，禁止冷凍，防止生物表麵活性劑膠束析出；
（5）混勻樣品輕柔顛倒離心管，嚴禁劇烈震蕩產生氣泡。
3.預實驗基線驗證
取空白餐廚發酵對照組上清上機檢測90 min動態表麵張力，確認空白體係張力曲線平穩，餐廚垃圾可溶性雜質不會造成張力明顯下降；再測試高活性預實驗樣品，確認儀器可以檢出餐廚發酵液當中胞外表麵活性物質。
三、標準化上機檢測完整操作流程
流程分為高通量初篩、優選樣品深度動力學檢測、油水界麵活性驗證三步
1.Delta‑8微孔板高通量初篩
1.使用多通道移液槍向96孔低吸附微孔板每孔添加50 μL發酵上清樣品；
2.微孔板蓋上蓋板減少水分揮發，恒溫靜置平衡30 min；
3.將微孔板安放至恒溫載板，啟動自動化序列檢測，每一個微孔重複測定三次，儀器自動輸出平均平衡表麵張力；
4.整板檢測結束之後啟動探針陣列高溫灼燒清潔；每隔16個樣品孔安放空白對照組，實時監測基線漂移。
2.Epsilon動態表麵張力精細檢測
將高通量篩選得到的低表麵張力優質樣品轉移至微量石英樣品杯，加入150 μL脫氣上清，閉合防風罩靜置10 min；開啟動態張力采集，采集時長90 min，獲取吸附誘導時間、張力下降速率、飽和平衡張力等動力學參數。
每一份樣品測試完畢火焰清潔探針，清洗樣品槽。
3.原油‑水液‑液界麵張力驗證
以發酵上清作為下層水相，原油緩慢鋪於上層，靜置20 min形成平整油水界麵；調整探針高度接觸油水界麵，測定油水界麵張力，評判發酵液對於疏水性油汙的乳化能力。
4.平行樣品質控標準
同一發酵上清三次平行檢測平衡表麵張力差值大於0.5 mN/m，樣品需要重新離心、脫氣複測；全部實驗組檢測溫度、靜置平衡時長、探針參數保持統一。
5.實驗收尾和儀器養護
所有樣品檢測結束，反複灼燒探針去除黏性發酵殘渣、多糖、表麵活性劑殘留物；微孔板、樣品槽乙醇浸泡清洗之後純水衝洗晾幹。導出全部張力數據、動態吸附曲線，歸檔發酵條件；探針防塵幹燥存放。
四、數據處理、菌株與發酵工藝篩選標準
1.提取界麵關鍵參數
獲取氣‑液平衡表麵張力、油水界麵張力、界麵吸附誘導時長、張力下降速率。
2.高產菌株篩選規則
相同發酵時間之下，油水界麵張力越低、張力下降速度越快，菌株利用餐廚垃圾合成生物表麵活性劑的能力越強；優先挑選平衡表麵張力可以下降至40 mN/m以下的菌株作為優勢菌株。
3.發酵工藝優化
對比各個pH、固液比、接種量、發酵時長組別張力數值，油水界麵張力最低組別即為最優發酵條件；
發酵前期菌體適應餐廚底物，表活分泌量低；發酵中期表麵張力快速下降；後期到達臨界膠束濃度之後張力趨於平穩。
五、關鍵實驗控製要點
1.餐廚垃圾發酵液含有大量黏性多糖、蛋白、油脂殘渣，極易黏附探針，每次檢測之後必須灼燒清潔；檢測順序由低發酵時長樣品到高活性發酵上清，降低交叉汙染。
2.全程檢測溫度固定，溫度會改變生物表麵活性劑膠束結構、分子擴散速率，溫度波動會帶來檢測誤差。
3.添加原油的時候動作平緩，不可劇烈攪動油水兩相，乳化液滴會破壞平整界麵，造成油水界麵張力讀數失真。
4.上清液清澈就省略過濾步驟，疏水生物表麵活性劑容易被濾膜吸附，造成測得張力偏高，低估發酵液活性。
5.表麵張力屬於多項胞外代謝物的綜合表征結果；如果需要測定表活產量、組分類型，後續開展有機溶劑萃取與色譜檢測。
6.微孔板檢測期間加蓋，減少微量樣品水分揮發濃縮引發的數據偏差。
